Alle cellen in een menselijk lichaam ontstaan uit één enkele cel, de bevruchtte eicel of zygote. Tijdens verdere ontwikkeling delen de cellen, nemen ze beslissingen over hun lotsbestemming en schakelen ze tussen verschillende celtypen en hun functionele status. Bij elke celdeling wordt de genetische code gekopieerd en doorgegeven aan de dochtercellen. Hoewel dit onder strikte controle staat, gebeuren er ook fouten. In de meeste gevallen hebben deze mutaties geen direct effect, maar soms kunnen ze ook ernstige gevolgen hebben, zoals bijvoorbeeld bij de geboorte van kinderen met een de novo genetische aandoening of bij de ontwikkeling van kanker. Kanker ontwikkelt door de accumulatie van genetische mutaties en chromosomale veranderingen die aanleiding kunnen geven tot verschillende klonale populaties. Bijgevolg is er genetische heterogeniteit binnen de tumor die in verband wordt gebracht met een verhoogd risico op geneesmiddelresistentie, metastase en herval. In veel studies wordt het genoom van een tumor in kaart gebracht door het DNA te sequensen dat uit miljoenen cellen wordt geëxtraheerd. Hoewel deze bulk-methoden belangrijke informatie opleveren, blijft het moeilijk om zeldzame en belangrijke subklonale celpopulaties op te sporen. Voor deze karakterisering van zeldzame subklonen of zeldzame kankercellen is het vereist om technieken toe te passen die het genoom van individuele cellen in kaart brengen. Met de ontwikkeling van multi-omica methoden voor individuele cellen (single-cells) werd het ook mogelijk om verschillende moleculaire klasses, bijvoorbeeld het genoom en het transcriptoom, van dezelfde cel te onderzoeken. Met single-cell genoom-en-transcriptoom-sequencing (G&T-seq) kunnen onderzoekers bijvoorbeeld zowel het DNA als het RNA van dezelfde cel bestuderen, en daarmee het gevolg van genomische veranderingen op cellulaire fenotypes bestuderen.

Aan het begin van mijn doctoraatsopleiding vereiste DNA-sequencing van individuele cellen (scDNA-seq) pre-amplificatie van het genoom, gevolgd door aanvullende fragmentatie en bereiding van de sequencing-bibliotheek, wat resulteerde in hoge productiekosten en een lage verwerkingscapaciteit. Maar alarmerender is dat pre-amplificatie, of amplificatie van het hele genoom (WGA) leidt tot een vertekend beeld van het genoom. Hoewel computationele methoden sommige van deze fouten kunnen inperken, blijven er onvolkomenheden bestaan die kunnen leiden tot de detectie van valse kopie-nummerveranderingen (CNV's) en valse enkel-nucleotide-varianten (SNV's) in de genomen van individuele cellen. Daarom was het hoofddoel van dit proefschrift om nieuwe methoden te ontwikkelen voor scDNA-seq die de nauwkeurigheid, doorvoer en kosteneffectiviteit verbeteren in vergelijking met de bestaande methoden. Hiertoe hebben we een methode ontwikkeld die gebaseerd is op single-cell genomische tagmentatie (Gtag), waarbij een voorgaande WGA-stap wordt overgeslagen en waarbij DNA-sequencing-bibliotheken rechtstreeks uit het lysaat van individuele cellen worden bereid. Hoewel deze fragmenten die tijdens tagmentatie ontstaan nog steeds worden geamplificeerd, kunnen de resulterende kopieën gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens de data-analyse. Dit resulteert in unieke fragmenten die gelijkmatig over het genoom gespreid liggen. We hebben Gtag geïmplementeerd in genoom-en-transcriptoom-sequencing (Gtag&T) en we hebben de nieuwe methoden vergeleken met conventionele technologieën voor scDNA(&RNA)-seq.

We vonden dat Gtag minder hands-on tijd vereist, de doorvoer verhoogt terwijl de kosten worden verlaagd en dat het genoom meer uniform wordt gedekt in vergelijking met conventionele methoden. Omdat de meest gebruikte transposase-adapters resulteren in het verlies van 50% van de gelabelde DNA-fragmenten, hebben we ook een nieuwe adapter ontwikkeld om op het Tn5-transposase te laden. Deze Y-vormige adapter voorkomt dat een enkelstrengs lineair DNA-molecuul dezelfde adaptersequentie ontvangt aan zowel het 5'- als het 3'-uiteinde, waardoor het verlies van symmetrische moleculen wordt omzeild. Hoewel we met succes het DNA van afzonderlijke cellen konden sequensen met behulp van deze nieuwe transposase-complexen (saGtagY), ondervonden we dat slechts een klein percentage van de fragmenten overeenkwam met het referentie genoom en dat er daardoor een afname was van de complexiteit van de bibliotheek in vergelijking met Gtag.

Vervolgens pasten we G(tag)&T-seq toe op 930 kernen geëxtraheerd uit vers ingevroren monsters van zeldzame borstkanker en op 341 cellen van een melanoom xeno-transplantaatmodel. In beide datasets ontdekten we dat Gtag niet alleen minder ruis heeft en minder positionele bias heeft in vergelijking met een conventionele scDNA-seq-methode, maar dat het ook toeliet om in silico accurate subklonale pseudo-bulk genomen te construeren door afzonderlijke cellen te clusteren en samen te voegen op basis van hun verschillen in DNA-kopieën. Deze maken een nauwkeurigere detectie van breekpunten mogelijk. Op het niveau van een individuele cel detecteren we in het melanoom xeno-transplantaatmodel focale amplificaties die zeer heterogene patronen vertonen in structuur, grootte en aantal kopieën zowel per cel als tussen de verschillende subklonen. Bovendien suggereren onze gegevens differentiële plasticiteit in de functionele status van de cel en behandelingsrespons tussen subklonen van kanker, evenals een subklonale verrijking van de focale amplicons.

Bovendien laten we door analyse van 39 blastomeren van 8 menselijke IVF-embryo's zien dat Gtag kan worden gebruikt voor de detectie van aneuploïdieën en ongebalanceerde translocaties en verder ontwikkeld kan worden voor klinische toepassingen.

Samengevat, we tonen aan dat methoden op basis van genomische tagmentatie uitstekend zijn voor het analyseren van het DNA van individuele cellen, voornamelijk wanneer het genoom gesequencet wordt aan lage dekking. Hoewel diverse biologische en biomedische applicaties voor de hand liggen, menen we dat Gtag het meest tot zijn recht komt wanneer zeer heterogene weefsels, zoals kankers, worden geanalyseerd en wanneer een hoge doorvoer en hoge nauwkeurigheid vereist zijn.

All the cells in a human body have arisen from one single cell, the zygote. Throughout development cells divide, make fate decisions, and transition between different cell types and cell states. Every cell division the genetic code is copied and passed on to the daughter cells. While this is under tight control, mistakes do occur. In most cases these mutations have no effect, but they can have severe consequences as is exemplified by the birth of children with a de novo genetic disorder or the development of cancer. Cancer develops by accumulating genetic mutations and chromosomal alterations which gives rise to distinct clonal populations. The resulting intra-tumour genetic heterogeneity is associated with an increased risk of drug resistance, metastasis and relapse. In many studies the genome of a tumour is charted by sequencing the DNA that is extracted from millions of cells. Although these bulk methods provide important information, inferring rare but important subclonal populations remains difficult. For the characterization of rare subclones or rare cancer cells, single-cell genomics is required. With the development of single-cell multi-omic methods it also became possible to investigate multiple omic layers of the same cell. For example, single-cell genome-and-transcriptome sequencing (G&T-seq) allows researchers to study both the genome as well as the transcriptome of the same cell, and hence, the consequence of genomic alterations to cellular phenotypes.

At the start of my doctoral training, single-cell DNA sequencing (scDNA-seq) required preamplification of the genome followed by additional fragmentation and sequencing library preparation which resulted in high production costs and low processing throughput. But more alarming was that preamplification, or whole-genome amplification (WGA), introduces biases. While computational methods can reduce some of these biases, imperfections remain and can cause detection of false copy number changes (CNVs) as well as false single nucleotide variants (SNVs) in single-cell genomes. Because of this, the main goal of this dissertation was to develop novel single-cell DNA sequencing methods that improved accuracy, throughput, and cost-effectiveness compared to the existing methods. To this aim we developed a method based on single-cell genomic tagmentation (Gtag), whereby WGA is omitted and whereby DNA sequencing libraries are prepared directly from single-cell lysates. While these fragments resulting from tagmentation are still amplified, their copies can be easily identified and collapsed into unique sequencing reads without redundant overlap and which are evenly distributed along the genome. We implemented Gtag into genome-and-transcriptome sequencing (Gtag&T) and we benchmarked the newly developed methods against conventional single-cell G(&T) sequencing technologies.

We found that Gtag requires less hands-on time, increases the throughput while lowering costs, and demonstrates improved coverage uniformity compared to conventional methods. Because the most commonly used transposase adapters result in the loss of 50% of the tagmented DNA fragments we developed a novel adapter to load onto the Tn5 transposase. This Y-shaped adapter prevents that a single-stranded linear DNA molecule receives the same adapter sequence on both its 5’ and 3’ end which bypasses loss of symmetrical molecules. Although we were able to successfully sequence the DNA of single cells using these novel transposase complexes (saGtagY) we experienced low mappability and a decrease in library complexity compared to Gtag.

Next, we applied G(tag)&T-seq to 930 nuclei extracted from fresh frozen rare breast cancer samples and to 341 cells from a melanoma xenograft model. In both datasets we found that Gtag, besides being less noisy and having less positional bias compared to a conventional scDNA-seq method, enables in silico construction of highly accurate subclonal pseudo-bulk genomes by clustering and merging single cells based on their DNA copy number. These in turn enable more precise breakpoint detection. At the single-cell level, we detect in the melanoma xenograft model focal amplifications that show highly heterogenous patterns in terms of structure, size, and number of copies both per cell and between the different subclones. Moreover, our data suggests differential cell state plasticity and treatment response between cancer subclones as well as a subclonal enrichment of the focal amplicons.

Furthermore, by analyzing 39 blastomeres from 8 human IVF embryos we show that Gtag can be used for the detection of aneuploidies and unbalanced translocations, which may be further developed for clinical application.

Taken together, we show that genomic tagmentation-based methods are an outstanding technology for analyzing the DNA of single cells, especially when performing low-coverage sequencing. While it is applicable to different fields we envision it contributes most when highly heterogeneous tissues, like cancer, are analysed and when a high throughput and high accuracy is required.